抗坏血酸（维生素C）的测定方法 |
| 发布时间：2005-09-06 |
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在测定维生素C的国标方法中，荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法，2、4－二硝基苯肼法作为第二法。
一、荧光法
1．原理
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022 g/ml。
2．适用范围
GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定
3．仪器
3．1．实验室常用设备。
3．2．荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。
3．3．打碎机。
4．试剂
本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。
（1）偏磷酸－乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4℃冰箱可保存7～10天。
（2）0.15 mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。
（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。
（4）50％ 乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。
（5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中。临用前配制。
（6） 邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。
（7） 0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。
变色范围：pH=1.2 红色
pH=2.8 黄色
pH＞4.0 兰色
（8） 活性炭的活化：加200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流1~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~120℃烘箱中干燥，备用。
（9）标准
抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。
抗坏血酸标准使用液（100μg/ml）: 取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值，如其pH＞2.2时，则应用溶液（4.3）稀释。
标准曲线的制备：取下述"标准"溶液（抗坏血酸含量10μg/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。
5.操作步骤
5.1 样品制备
全部实验过程应避光。
称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40~100μg/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。
5.2 氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。
5.3 各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"标准"及"标准空白"。
5.4 各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"样品"及"样品空白"。
5.5 于"标准空白"及"样品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50ml，在4℃冰箱中放置2h，取出备用。
5.6 于"样品"及"标准"溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。
5.7 荧光反应
取"标准空白"溶液，"样品空白"溶液及（5.6）中"样品"溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。
6. 计算
X=（c×V/m）×F×(100/1000)
式中：X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；
c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，μg/ml；
m-----试样质量，g；
F------样品溶液的稀释倍数；
V------荧光反应所用试样体积，ml。
例： 测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。
由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（μg/ml），按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。
如：取制备好的辣椒样品2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml
样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg。
2.23×100 50 100
-----×-×-- = 52（mg/100g）
2.138 10 1000
7. 注意事项
7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。
7.2 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。
7.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。
二、2，4-二硝基苯肼法
1．原理
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。
2．适用范围
GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3. 仪器
3.1恒温箱：37±0.5℃
3.2可见-紫外分光光度计
3.3打碎机
4．试剂
本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。
4.1 4.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml。
4.2 85%硫酸：谨慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中。
4.3 2%2，4-二硝基苯肼溶液：溶解2g 2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。
4.4 2%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中，稀释至1000ml。
4.5 1%草酸溶液：稀释500ml 2%草酸溶液到1000ml。
4.6 1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml 1%草酸溶液中。
4.7 2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。
4.8 1mol/L盐酸：取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml。
4.9 活性炭：将100g活性炭加到750ml 1mol/L盐酸中，回流1~2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。
4.10 标准
（1）抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：溶解100mg纯抗坏血酸于100ml 1%草酸溶液中。
（2）标准曲线绘制
加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动1min，过滤。
取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为20μg/ml。
取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10及12μg/ml。
按样品测定步骤形成脎并比色。
以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。
5. 操作步骤
5.1样品制备
全部实验过程应避光。
5.1.1鲜样制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。
5.1.2干样制备：称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。
5.1.3将上述两液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。
5.2氧化处理：取25ml上述滤液，加入0.5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10ml此氧化提取液，加入10ml 2%硫脲溶液，混匀。
5.3呈色反应
5.3.1于三个试管中各加入4ml稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。
5.3.2 3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0ml 2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置10~15min后放入冰水内。其余步骤同样品。
5.3.3 85%硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试管中加入5ml85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。
5.3.4 比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。
6. 计算
同荧光法。
7. 注意事项
7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。
7.2 若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。
7.3 试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。 |
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