茶多糖生物活性与结构的研究进展 |
| 发布时间：2005-09-13 |
|
糖类是自然界最多的有机化合物，也是重要的生物高分子化合物和重要的信息分子。多糖及糖复合物分布广泛，功能多种多样，它们参与了细胞各种生命活动的调节。有的多糖具有特殊生物活性，是一种免疫调节剂，且无毒副作用，而被作为临床用药或疫苗。茶多糖ＴＰＳ能降血糖、防治糖尿病，还具有降血脂、抗动脉粥样硬化、降血压、抗凝血、抗血栓、防治心血管疾病等作用，它还能使血清凝集素抗体增加，从而增强机体免疫功能。
我国研究较多的多糖类是微生物来源多糖，现已发现有价值的真菌多糖近３０种，其中化学结构较清楚的有１５种，香菇多糖是研究最多、较为深入的多糖之一，但至今对其活性与构效关系并不清晰，仅了解其结构与免疫活性相关的是β葡聚糖物质。这些研究的深入，将为发现更有效的新多糖起指导作用，也将对药物学、分子生物学的理论作出贡献。
茶多糖生物活性与结构，这些年已有所研究，且取得了一些进展。本文对这方面的研究进行综述，并提出一些问题进行探讨。
一、 茶多糖的提取与分离
茶多糖的提取，通常是将茶叶磨碎，用热水７０～１００℃浸泡３０ｍｉｎ，浸泡液减压浓缩后，加入３倍体积乙醇沉淀、离心，沉淀物再用少量水溶解，重复醇沉淀一次，沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚交替洗涤三次，真空低温干燥，得茶多糖粗制品，得率为１２％～１８％。该粗制品中茶多糖含量为２７５２％～２９３２％，茶多酚含量为１１８６％～１４４９％，可溶性蛋白含量为１５０％～１７８％。茶多糖的提取应避免在强酸强碱溶液中进行，否则易使茶多糖中糖苷键断裂及构象变化，从而失去或降低生物活性。茶多糖提取也可用冷水、稀碱、稀酸或稀盐进行，若用稀酸提取，时间宜短，温度不宜超过５℃；用稀碱提取，应在氮气中进行，以防止多糖降解；热水浸提得率高于冷水。
茶多糖的初步纯化是采用Ｓｅｖａｇ方法除去蛋白质，此法条件温和，但效率不高，茶多糖粗制品中游离蛋白质含量在１０％左右。经Ｓｅｖａｇ法脱蛋白４～５次后，用蒸馏水透析２４ｈ，然后经醇析，真空低温干燥可得到茶多糖。
茶多糖的进一步纯化，有多种方法，如ＤＥＡＥ纤维素柱层析、凝胶层析分离、凝胶电泳法与ＨＰＬＣ法等。如茶多糖用少量水溶解后，再通过Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５柱２６ｃｍ×８０ｃｍ与Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１５０柱１５ｃｍ×６０ｃｍ层析，可进一步纯化。用０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ洗脱，收集含糖部分，醇析后透析，真空低温干燥可得茶多糖纯品。
二、 茶多糖的纯度及其测定方法
茶多糖的纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为茶多糖纯品其微观上也是不均一的，其纯度只代表相似链长的平均配布，纯品也仅是一定分子质量范围的均一组分。茶多糖的纯度可用物理与化学方法检测：①用水解法在重复纯化过程中单糖组成及其比例不变，理化性质溶解度、比旋度等也不变，则表明是均一组分。②多糖溶液也可以进行密度梯度离心，在６００００ｒ／ｍｉｎ以上可得到单一峰，即说明多糖是均一组分。③茶多糖经凝胶层析得一对称峰，也证明茶多糖为均一组分。④茶多糖经高压电泳，如呈单一色斑，则表示茶多糖为均一组分。目前，采用高效液相层析或凝胶层析来检测茶多糖的分离纯化度。
三、 茶多糖的化学组成
茶多糖由茶叶中的糖类、蛋白质、果胶和灰分等物质组成，茶新梢的粗老叶中含量较高。茶多糖为水溶性，易溶于热水，不溶于高浓度的有机溶剂。高温下易丧失活性，过酸或偏碱均会使多糖部分降解。从分离纯化后的茶多糖的紫外吸收图谱能表明茶多糖中存在蛋白质，即茶多糖中多糖与蛋白质呈紧密结合态。纯化后茶多糖中糖蛋白含量为８８９３％，可与多种金属元素络合。清水岑夫等从茶叶冷水提取物中分离的茶多糖，分子量为４００００，由阿拉伯糖、核糖和葡萄糖５１∶４７∶１７组成；王丁刚等提取的茶多糖分子量为９１０００，由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖０２３∶１０４∶０６２∶２４３∶１００组成；汪东风等分离的茶多糖分子量为１０７０００，由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖５５２∶２２１∶６０８∶４４２∶４１９９组成；陈海霞等用热水提取茶多糖后，用醇沉淀或超滤醇沉淀等方法分离制取茶多糖，所制茶多糖由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、半乳酸及半乳糖醛酸组成，但制取工艺不同组成比例也不同。这些报道中茶多糖组成差异被认为与所用茶叶原料和提取分离方法不同有关。但也可粗略看出，茶多糖的单糖组成是以半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖为主，还有木糖和甘露糖等。至今茶多糖中单糖存在键型及其连接方式尚未分析清楚，至于高级结构更未触及。
四、 茶多糖化学组分的结构分析
茶多糖经过分离纯化，被确认为单一多糖后便可进行结构分析，已使用的分析手段主要有物理方法和化学方法。物理方法常使用的有：①ＧＣ和ＧＣＭＳ联用方法：用于测出多糖的组成及各单糖之间的摩尔比，此法要求所测样品具有一定的挥发性，因此待测样品多需制备成硅烷衍生物和乙酰化衍生物等。②核磁共振光谱ＮＭＲ法：用于确定多糖结构半糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目。一般用１ＨＮＭＲ图测定简单多糖，１３ ＣＮＭＲ测定复杂的多糖，因为后者的化学位移较宽些。③紫外光谱法：在２６０～２８０ｎｍ处用于检测多糖中是否含有蛋白质、核酸、多肽类。④红外光谱法：用于确定吡喃糖的糖苷键构型及其他官能团。化学方法中以酸水解法应用最多，它可分为完全水解法和部分酸水解法，用于鉴定多糖中单糖组分或多糖中的低聚糖。其他化学方法有过碘酸氧化、Ｓｍｉｔｈ降解、甲基化反应、碱降解等化学降解法，用于多糖结构中苷键的构型、单糖之间的连接部位确定等。但在使用时，通常需要物理方法和化学方法结合起来，才能完成多糖的结构测定。
五、 茶多糖的活性与结构
多糖糖链庞大或修长，如具有生物活性，必然存在活性中心或片段，也就是说，研究多糖的结构必须寻找活性中心结构。多糖的结构，首先应确定其一级结构，再深入其高级结构，多糖结构确定是困难的，特别是杂多糖结构确定难度更大，这里涉及到的因素很多，首先是多糖的分级纯化，粗制多糖是非常复杂的大混合物，其中有生物大分子混合，如不同多糖中性多糖、酸性多糖和杂多糖的混合，还有同种多糖大小分子的混合等，这就必须采用适合其特点的方法来分离分级纯化，否则多糖不纯，结构确定有困难。实践表明，同一绿茶样品用不同分级方法茶多糖得率及其生物活性常有不同结果。从同一绿茶样品中，可分离出几种结构、分子大小、溶解度、粘度不同的多糖，其药物活性也有差异。也有许多试验结果表明，粗多糖经过逐步纯化，其药物活性并未见增加，这被认为是多糖的药物活性可能是由不同多糖共同作用的结果。因此，研究茶多糖时即应研究分级纯化的多糖结构，也应注意混合多糖的结构变化，特别是构象变化，水溶性多糖混合物，糖链间氢键的交联，必然会引起构象变化，从而影响到生物活性。
总之，多糖的结构和生物活性关系是多糖研究的热点与难点，现已清楚高级结构对功能的影响最为重要，其中立体构型是多糖生物活性的决定因素之一，另外分子量、取代基、溶解度、粘度等等都能影响其生物活性。现在国内外研究的主要目标是寻求活性更高，特别是对肿瘤、艾滋病、心血管疾病更有效的多糖。
我国多糖研究与美、英、日等国差距很大，现仅局限于用经典的化学方法来测定其一级结构，有关立体构型方面的研究则还未见开展。而多糖活性与二级结构乃至三级结构的关系更为密切，因此研究多糖的立体构型更有利于阐明多糖的构效关系。 |
|
|
|
