粗多糖的测定方法 |
| 发布时间：2005-09-13 |
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1. 原理
分子量大于10，000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。
2. 适用范围
参照AOAC方法。适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。
3.仪器
（1） 分光光度计
（2） 离心机
（3） 旋转混匀器
（4） 恒温水浴锅
4.试剂
除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
（1） 80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。
（2） 2.5 mol/L NaOH溶液：100 g NaOH加蒸馏水稀释至1 L，加入固体无水硫酸钠至饱和。
（3） 铜贮存液：称取3.0 g CuSO4 ·5H2O，30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。溶液可贮存2周。
（4） 铜应用溶液：取铜贮存液50 ml，加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。
（5） 洗涤液：取水50 ml，加入10 ml铜应用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液，混匀。
（6） 1.8 mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。
（7） 20 g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。
（8） 葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0 mg/ml。
（9） 葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。
5. 操作方法
5.1 样品处理
（1） 样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml （V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。
（2） 沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml （V2），置于烧杯中，加热浓缩至10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。
（3） 沉淀葡聚糖：上述残渣用水溶解，并定容至50ml （V3），混匀后过滤，弃初始滤液后，取滤液2.0ml （V4），加入2.5mol/L NaOH 2.0ml，Cu应用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim，冷却后以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用洗涤液洗涤3次，残渣供测定葡聚糖之用。
（4） 测定葡聚糖：上述残渣用2.0mL 1.8mol/L H2SO4溶解，用水定容至100mL（V5）。准确吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，沸水浴煮沸2分钟，冷却比色。从标准曲线上查得相应含量，计算粗多糖含量。
5.2 标准曲线制备：
精密吸取葡聚糖标准应用液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00ml（分别相当于葡聚糖0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20mg），补充水至2.0mL，加入苯酚溶液1.0ml，浓硫酸10ml，混匀，沸水浴2分钟，混匀，沸水浴2分钟，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度值（A），以葡聚糖浓度为横坐标，A为纵坐标绘制标准曲线。
6.计算
从标准曲线上查得样品相应含量，计算粗多糖含量。
c×V5×V3×V1×0.1 c×250
葡聚糖（%）= ---------------------- = ------------ ……………
V6×V4×V2×m m (1)
公式中：c--从标准曲线上查得样品测定管中葡聚糖含量，mg；
V1--样品提取时定容体积，ml；
V2--沉淀高分子物质取液量，ml；
V3 --沉淀葡聚糖时定容量，ml；
V4 --沉淀葡聚糖时取液量，ml；
V5 --测定葡聚糖时定容体积，ml；
V6 --样品比色管中取样液体积，ml；
m--样品称量质量，g；
0.1--将mg/g 换算成g/100g 的系数。
7.注意事项
（1） 苯酚-H2SO4溶液可以和多种糖类进行显色反应，常用于总糖的测定。所以测定过程中应注意容器及试剂中其他糖类的干扰。
（2） 苯酚-H2SO4溶液和不同类的糖反应，显色的强度略有不同，反映在标准曲线的斜率不同。如果已知样品中糖的结构，应尽量以同类糖的纯品做标准品，或以含有已知浓度的同类产品做对照品进行检测分析；如果样品中糖的类型未知或结构多样，则只能以葡萄糖计或其他糖计报告结果。
（3） 试验证明葡萄糖、果糖等单糖，蔗糖、乳糖等双糖、低聚糖--棉子糖，淀粉、糊精等多糖及甜味剂糖精不干扰粗多糖测定。
（4） 本方法由北京市卫生防疫站建立，经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所验证。 |
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